Der Museumswächter Larry Daley entdeckt, dass sein Liebling, und einige seiner besten Freunde fehlen und wird vom New York's Museum für Naturgeschichte zu den Archiven am Smithsonian fortgeschickt. Larry bekommt einen Notruf vom Miniaturcowboy Jedediah, berichtend, dass sich das ägyptische Lineal Kahmunrah und ein Trio von abscheulichen Gefolgsmännern - nämlich Ivan das Schreckliche, Napoleon und Al Capone - verschwören um das Museum und die Welt zu übernehmen. Zum Nation's Kapitol eilend, ist Larry nicht ganz klar im Kopf. Aber mit einigen neuen Freunden, einschließlich des unbezähmbaren Amelia Earharts, zusammen mit vertrauten Freunden Teddy Roosevelt und Octavius, wird Larry nichts unversucht lassen, den Smithsonian vor der Morgendämmerung wieder herzustellen.